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联硕生物带你绕开ELISA试验中呈现的各种问题
浏览次数:109发布日期:2019-06-14

ELISA是蛋白定量的金规范,也是免疫学研讨中常用的试验办法之一。很多人觉得ELISA很简单,其实不然。今天联硕生物带你绕开ELISA试验中呈现的各种问题,轻松搞定ELISA试验~

 

1.间接法

检测抗体常用的办法, 首要用于对病原体抗体的检测。
优势:二抗能够加强信号,并且有多种挑选能做不同的测定剖析。不加酶符号的一级抗体则能保存它多的免疫反应性。
缺点:交互反应发生的机率较高

2.双抗体夹心法

检测大分子抗原常用的办法。
优势:高活络、高专一性,抗原无须事前纯化。
缺点:抗原必定得具有两个以上的抗体结合部位。

3.竞争法

检测小分子半抗原(药物、激素等)。
优势:可适用比较不纯的样本,并且数据再现性很高。
缺点:整体的敏感性和专一性都较差。

常见问题剖析

Q1.标曲不显色或显色很弱,样本显色

溶解规范品以及倍比稀释时,未涡旋震动或不行充沛。
规范品溶解、倍比稀释时均需求涡旋震动以保证充沛混匀。单纯依托移液器重复吹打,效率较低、作用也不必定jia。

Q2.标曲和样本均不显色

在孵育阶段静置在桌面上,这样非常不利于抗原抗体之间的充沛接触,导致显色偏弱。
推荐孵育阶段,运用ELISA专用的微孔板振荡器,调至适宜的频率,使抗原抗体充沛接触,保证结合作用。假如排除上述原因,有可能是漏加了某个组分,如检测抗体、酶等。关于比较大意的新手,必定要做好符号和记录,或者运用增加染料的ELISA试剂盒。

Q3.标曲显色,样本不显色

当样本中意图蛋白浓度极低或者样本中搅扰要素较强,就无法检测到。现在ELISA仍然是蛋白检测活络度gao的办法,与不同技能结合后,衍生出了多种类型的ELISA,提高了检测活络度。

关于意图蛋白浓度特别低的样本,能够尝试用高敏ELISA,但这也并不意味着必定能检测到样本浓度,只能说能够提高样本的可测率,并使成果愈加牢靠。因为通常用一般ELISA检测的样本OD值都偏低,而高敏ELISA可提高样本OD值,使之尽量位于标曲范围内,得到的数值也愈加可信。

Q4.标曲和样本都显色,但复孔的CV大

这个问题就跟移液器和试验者的操作有关了。移液器的运用维护不规范,就会造成移液的误差较大;试验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。
掌握移液器的正确运用和维护。关于个人的操作可操练移液动作、加快速度,保证移液的精密度。

Q5.本底偏高,样本值测不到标曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(关于高敏ELISA能够恰当放宽要求)。尤其是样本值特别低的时分,本底过高会掩盖意图信号,导致无法测到样本值。
在参加TMB显色后,需实时观察标曲显se状况。通常在S5孔有肉眼可见的微弱蓝色,即可停止反应。

Q6.样本经不同梯度稀释,核算得到的样本值差异较大

有时分咱们不清楚样本中意图蛋白的浓度怎么,应该怎么稀释,那么咱们就会做下预试验,确认稀释倍数。但是有时分同一样本做了几个不同梯度稀释后,核算得到的样本值之间差异较大,应该挑选哪一个稀释倍数呢?

 

这里触及到了基质效应。通常血清样本加样量较高时,血清中的各种蛋白会抑制抗原抗体的接触,基质效应较显着。而经过稀释后,搅扰要素也随之稀释,影响就会较小。当某两个梯度稀释后,核算得到的样本值挨近时,咱们就能够以为在该稀释梯度时,样本中的搅扰要素影响较小,核算得到的值也是挨近真实的。但是这样的稀释是针对意图蛋白浓度较高的样本而言。关于浓度很低的样本,经过多倍稀释后,就愈加测不到了,此刻可依照厂家说明书推荐的加样方法操作。

Q7.不同试剂盒中的组分能否通用

除非是共用的试剂如洗液、检测缓冲液,其它组分不建议用其它试剂盒的组分,乃至是同一指标不同批次的试剂盒里的组分。这些组分(包含规范品、规范品稀释液、检测抗体、酶等)都是经过优化的,假如轻率运用其它试剂盒的组分,有可能对成果产生影响。

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