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牛肉真空冷冻低温腐败菌的分离与鉴定

日期:2017-12-2 来源:www.wxerxiang.com  咨询热线:18861155999  立即咨询

低温肉制品是指在常压下通过蒸•●、煮•●、熏•●、烤等热加工过程使肉制品的中心温度控制在6872 ℃,并且需要在04 ℃的低温环境下贮藏•●、运输及销售的一类肉制品。与高温肉制品(通常采用121 ℃•●、0.1 MPa的高温高压加热方式)相比,低温肉制品能够最大限度地保留肉类原有的营养成分及风味物质,是世界肉类产品的发展趋势。低温肉制品在蒸煮阶段一般采用6872 ℃的杀菌工艺,冷却后在无菌车间进行切分,真空包装为此类肉制品的主要包装形式,保质期一般为24 周,保质期的长短主要取决于初始菌量及贮藏温度。

本研究对真空包装低温熟牛肉中的腐败菌进行菌株的培养•●、分离与纯化以及PCR扩增,通过扩增核糖体DNA限制性分析(amplified ribosomal DNA restriction analysis,ARDRA),并对菌株的生理生化特性进行研究,为进一步采取有效的防腐保鲜措施•●、延长产品的货架期提供参考。

 

1•●、菌株的菌落特征及PCR鉴定结果

本研究分别采用涂布法和倾注法对菌株进行培养,根据样品稀释液在BHI培养基上所生长细菌菌落的表型差异,共筛选出12 株腐败菌,编号为n01n12,12 株菌的基本形态特征如表1所示。菌株的分离和筛选主要依据其形态•●、颜色等特征,不排除筛选出同一种属•●、甚至同一菌株的可能性。

 

所有菌株经过PCR扩增(16S rDNA)后均出现了清晰可辩的特异性条带,条带大小为1 500 bp左右。其中菌株n01•●、n04•●、n05•●、n09•●、n10PCR扩增结果如图1所示。

 

2•●、ARDRA结果

ARDRA是限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)在核糖体DNA序列上的应用。最初的RFLP技术的依据是不同生物个体之间DNA片段的酶切位点有所差异,经限制性内切酶消化后能够产生长短•●、种类•●、数目不同的限制性片段,基于对限制性片段的分析,从DNA水平比较不同个体之间的差异。ARDRA则是根据16S rDNA基因序列的限制性片段区分菌株种的差异。

 

12 株菌的16S rDNA分别经EcoRⅠ和SpeⅠ双酶切•●、TaqⅠ单酶切后,均可获得便于区分的酶切图谱。根据条带的相似性可以将12 株菌分为5 组,第1组包括n01•●、n02•●、n03n08,第2组包括n05•●、n06n07,第3组包括n09n11,第4组包括n10n12,第5组仅包括n04。同一组内菌株的酶切图谱具有较高的相似性,表明这些菌株之间存在一定的亲缘关系。

 

3•●、菌株系统进化树的构建

n01n08与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)•●、n02与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)•●、n03与特基拉杆菌(Bacillus tequilensis)亲缘关系最近,它们均属于芽孢杆菌属(Bacillussp.);n04与嗜冷杆菌属(Psychrobactersp.)亲缘关系最近;n05•●、n06n07与魏斯氏菌属(Weissellasp.)亲缘关系最近;n09n11与链球菌属(Streptococcussp.)亲缘关系最近;n10n12与肠球菌属(Enterococcussp.)亲缘关系最近。

 

4•●、菌株的生理生化鉴定结果

参照GenBank比对结果,根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株进行相应的生理生化鉴定。由表2可知,n01n08为枯草芽孢杆菌,n02为解淀粉芽孢杆菌,n03为特基拉芽孢杆菌,n04为嗜冷杆菌属的Psychrobacter urativorans(暂无中文命名),n05•●、n06n07为魏斯氏菌属中的绿色魏斯氏菌,n09n11为巴黎链球菌,n10n12为粪肠球菌。

 

结论

本研究对真空包装低温熟牛肉中的腐败菌进行分离,并结合表型分析•●、ARDRA•●、系统进化树的构建对菌株进行鉴定。结果表明,分离得到的12 株菌中,4 株为芽孢杆菌属,3 株为绿色魏斯氏菌,2 株为巴黎链球菌,2 株为粪肠球菌,1 株为嗜冷杆菌。其中,绿色魏斯氏菌是导致样品变绿的主要原因,总体来说,乳酸菌是真空包装低温熟肉制品中的主要腐败菌。本研究为进一步采取有效的防腐保鲜措施•●、延长低温肉制品的货架期提供了理论依据。


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